[سهم عبس]

•تقنية استخلاص الـدنا DNA من الخلايا المناعية Buffy coat

يتم بهذه التفنية استخلاص الحامض النووي الدنا (DNA) من الخلايا المناعية باستخدام كاشف QIAamp® DNA Mini andBlood Mini
هذا الكاشف يستخلص الحمض النووي DNA من 50 عينة فقط وهو من شركة QIAGEN®

محتويات الكاشف:

1.يحتوي الكاشف على 50 أنبوبة سعة 2 مل .
2.عبوة محلول AL* ( Buffer AL*) .
3.عبوة محلول AW1* المركزة ( Buffer AW1* Concentrate) .
4.عبوة محلول AW2 المركزة (Buffer AW2 Concentrate ) .
5.عبوة محلول AE 2 ( Buffer AE 2) .
6.عبوة إنزيم البروتييز ( QIAGEN Protease 1 vial).
7.عبوة 1,2 مل محلول مذيب إنزيم البروتييز ( Protease Solvant).
8.يحتوي الكاشف على رؤوس الأنابيب المفلتره ( QIAamp Maxi Spin Columns).
ملاحظات قبل اجراء الاختبار:

1-جميع خطوات العمل يجب أن تتم في درجة حرارة الغرفة (20ºم - 25ºم )
2-يسخن السطح الساخن ( Heat Block) الى درجة حرارة 56˚م وترقم الأنابيب سعة 2 مل بعدد العينات.
3-يتم اخراج العينات من الفريزروتترك حتى تأخذ درجة حرارة الغرفة
(20ºم - 25ºم ), بعد ذلك يتم البدء بالتحضيرات .

التحضيرات :

1-يذاب انزيم البروتينيز الجاف في المحلول المذيب المرفق معه وبعد اذابتة يقسم الى عدة أقسام في عبوات معقمة يحتوي كل منهاعلى 400µ من الإنزيم , وتحفظ العبوات غير المستخدمة في درجة حرارة (-20˚م) ويسجل على كل عبوة اسم الإنزيم وتاريخ التحضير.
2-تحضير محلول (AW1) وذلك باضافة 25 مل من كحول الايثانول 100% الى العبوة.
3-تحضير محلول (AW2) وذلك باضافة 30 مل من كحول الايثانول 100% الى العبوة.
خطوات اجراء الإختبار:
1-ترقم أنابيب جهاز الطرد المركزي الصغيرة سعة 1,5 مل بعدد العينات المراد استخلاص الحمض النووي ( (DNA منها.
2-يوضع 20µ من انزيم البروتينيزالمحضر في قاع جميع الأنابيب المرقمة.
3-يضاف 200µ من كل عينة من عينات الخلايا البيضاء المحفوظه في المحلول الملحي PBS) ) الى الأنابيب المرقمة مع مراعاة وضع كل عينة في الأنبوبة التي تحمل نفس الرقم .
4-يضاف 200µ من محلول AL)) لجميع العينات ( ثم تغلق الأنابيب جيدا منعا للتلوث) وتخلط بواسطة جهاز الرج ( Vortex) لمدة 15 ثانية .
5-تحضن الأنابيب في السطح الساخن عند درجة حرارة 56˚م لمدة 10 دقائق .
6-توضع الأنابيب في جهاز الطرد المركزي لمدة 5 ثواني لازالة القطرات من الغطاء .
7-يضاف 200µ من كحول الايثانول 100% للعينات ويخلط جيدا بواسطة
جهاز الرج ( Vortex) ثم تغلق الأنابيب وتوضع في جهاز الطرد المركزي لمدة 15 ثانية .
8-تجهز الفلاتر بتركيبها على أنابيب 2مل وترقم بأرقام العينات .
9-بحرص بالغ يوضع ناتج كل أنبوبة في الخطوة 6 على الفلتر المركب على أنابيب 2مل مع مراعاة عدم تلوث عنق فلترالأنبوبة ثم تغلق الفلاتر وتوضع جميع الأنابيب في جهاز الطرد المركزي على سرعة 8000rpm لمدة دقيقة واحدة بعد ذلك يتم التخلص من الأنابيب الخارجية القديمه المحتوية على السائل المفلتر وتستبدل بأنابيب خارجية جديدة .
10-بحرص شديد يضاف 500µ من محلول(AW1) مع مراعاة عدم تلوث عنق فلترالأنبوبة وتغلق فلاترالأنابيب وتوضع في جهاز الطرد المركزي على سرعة 8000rpm لمدة دقيقة واحدة , تنقل الأنابيب من جهاز الطرد المركزي الى حامل الأنابيب ويستبدل الأنبوب السفلي بآخر جديد .
11-بحرص بالغ يفتح غطاء الفلتر ويضاف 500µ من محلول (AW2) مع مراعاة عدم تلوث عنق فلترالأنبوبة ثم تغلق فلاترالأنابيب وتوضع في جهاز الطرد المركزي على أعلى سرعة 14000rpm لمدة 3 دقائق ولمزيد من النقاء يمكن تغيير الأنبوبة ووضع الأنبوبة في جهاز الطرد المركزي مرة أخرى لمدة دقيقة واحده فقط ثم يتم التخلص من الأنابيب الخارجيه المحتويه على السائل المفلتر.
12-يوضع الفلتر في أنابيب جديدة سعة 2 مل ويضاف200µ من محلول AE) ) أو من الماء المقطر وتغلق فلاترالأنابيب وتحفظ في درجة حرارة الغرفة لمدة دقبقة واحدة بعد ذلك توضع في جهاز الطرد المركزي عند سرعة 8000 rpm لمدة دقيقة واحدة بعد ذلك تنقل الأنابيب من جهاز الطرد المركزي الى حامل الأنابيب ويحفظ الـدنا (DNA ) الموجود بها عند (-20˚م ) لحين الإستخدام.
•الكشف عن وجود الحامض النووي النقي (Pure DNA) أوالحامض النــــــووي المكبـــــــــر (Amplicon DNA) بواسطة ترحيلة في هلامة الأجار بإستخدام طقم الفصل الكهربي (Agrose Gel Electrophoreses)
يتم الكشف عن وجود الحامض النووي النقي وكذلك الحامض النووي المكبر بواسطة تمريره في هلامة الأجار المغمورة في جهاز الفصل الكهربي (Agrose Gel Electrophoreses).

العينة المستخدمة :
1.عينة الحمض النووي النقي(Pure DNA) المستخلص من الخلايا المناعية لجميع أفراد مجموعة العمل.
2.عينة الحامض النووي المكبر(DNA Amplicon) باستخدام تقنية ((PCR.

الأدوات اللازمة لإجراء الاختبار:
1.طقم الفصل الكهربي (Agrose Gel Electrophoreses)
ويتكون من:
•طبق بلاستيكي للأجار.
•أمشاط تثبت على الطبق لزوم تشكيل نقر على هلامة الأجار.
•الحاوية المتنقلة الداخلية لجهازالفصل وهي متصلة بالدائرة الكهربائية.
2.أنابيب اختبار سعة 2مل بعدد العينات.
3.محلول TAE)) (Tries Acetate EDTA)
4.جهاز الأشعة الفوق بنفسجية.
5.دورق زجاجي.
6.لهب بنزين.
7.شريط لاصق.
8.مقدار من صبغة بروميد الفينيل الزرقاء (Bromo phiynile blue) (مذوبه في كمية متساويه من الجلسرين والماء).
التحــضيــر :
1)يتم اذابة العينات من الفريزر(Pure DNA) أو (DNA Amplicon) وتترك في درجة حرارة الغرفة من (20°م-25°م).
2)يضاف مقدار من مسحوق الأجار الى محلول (TAE Buffer) المذاب في الماء المقطر بنسبة تركيز 2% ويذوب الخليط جيدا" بداخل دورق زجاجي , يوضع الدورق على اللهب مع التحريك المستمر حتى يتم ذوبان الأجار تماما" وحتى يتجانس المخلوط.
3)يترك محلول الأجار لبعض الوقت حتى تنخفض درجة حرارته قليلا".
4)يضاف إلى الدورق مقدار من صبغة الاثيديوم بروميد(Ethidum Bromide)
مع توخي الحرص عند استخدامها فهي مادة مشعة مسرطنة وسامة , يقلب الدورق حتى تتجانس الصبغة مع الأجار.
5)يجهز طبق الأجار بغلق حوافه الأربعة بالشريط اللاصق العريض حتى يصبح الشريط كالجدار العازل المانع لتسرب الأجار من الطبق قبل أن يجمد.
6)يصب محلول الأجار المحضر في الطبق المجهز ثم تثبت الأمشاط على مسافات متساوية في أماكنها المخصصة لها و يترك الطبق لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة من (20°م-25°م) حتى تجمد هلامة الأجار.
7)ترقم أنابيب سعة 2 مل بأرقام العينات المختبرة ثم يوضع
من كل عينة10µ في الأنبوبة المخصصة برقمها.
8)يوضع على كل أنبوبة5µ من صبغة بروميد الفينيل الزرقاء (Bromo phiynile blue) الى نهاية العينات.
9)تزال الأمشاط والشريط اللاصق من الطبق .
10)يوضع من كل عينة (Pure DNA),(Amplicon DNA) مقدا5µ في النقرة المخصصة له في هلامة الأجار.
11)يوضع الطبق في حاوية جهاز الفصل الكهربي ويغمر بمحلول الغمر TAE)).
12)تفتح دائرة الفصل الكهربائية لكي يمر التيار خلال هلامة الأجار فيعمل على ترحيل الحامض النووي النقي أو المكبر من القطب الموجب إلى القطب السالب .
13)يترك الطبق حوالي 60دقيقة وبعد مرور الوقت تظهر خطوط بنفسجية اللون تشير إلى وجود الحامض النووي (Pure DNA), (Amplicon DNA) ويمكن الكشف عن هذه الخطوط بواسطة الأشعة الفوق بنفسجية (UV.System) .

الموضوع الأصلي: •تقنية استخلاص الـدنا DNA من الخلايا المناعية Buffy coat باستخدام كاشفQIAGEN | | الكاتب: سهم عبس | | المصدر: شبكة بني عبس

[شداد المظيبري]

يعطيك العافية سهم عبس

ع الموضوع والطرح الرائع

[------------]

مشكور أخوي و يعطيك العافيه

[سهم عبس]

مشكورين على مروركم الطب
ولاهنتم